本實驗要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉染受體細胞,這樣可使受體細胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性,這樣即使癌基因沒有出現明顯的“轉化灶”,也可測出轉入的外源性基因的抗neo的標記。而且還可利用被neo基因導入的受體細胞通過G418選擇培養篩選轉化的細胞建立細胞株。若以獲取 “轉化灶”為目的,可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細胞中提取的基因組DNA導入受體細胞即可,其方法如下:
1.基因組DNA轉染:
(1)配制磷酸轉染液
NaCl 8.0g
Hepes 5.0g 用時現配,pH很重要一定要控制在6.95±0.65
Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存備用
加溫水至 1000mL
(2)按前面介紹的方法提取癌細胞基因組DNA。
(3)取供體基因組DNA50~100μg,加3M NaCl或醋酸鈉,使zui終濃度至0.3M混勻。
(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘,去上清。
(5)加入轉染緩沖液,待DNA充分溶解后,再加入2.5MCaCl2,含zui終濃度為125mM,用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結),置室溫下10~30分鐘,待液體透明度降低,出現微濁蘭色時,即可用于轉染細胞。
(6)取生長狀態良好處于半匯合階段的對數生長期細胞,在轉染前4小時,更換培養液(5ml/瓶)1次。
(7)轉染:向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5~1mL/瓶,置37℃作用4~6小時。
(8)培養:棄去培養液,用15%甘油處理3分鐘,無血清培養漂洗1次,接近匯合時血清用量降至5%,培養2~3周。
(9)檢測:逐日觀察,待出現“轉化灶”后,克隆分離,擴大培養建立轉化細胞株。
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