商品屬性：

產(chǎn)品名稱：海藻糖6磷酸合成酶(TPS)生化檢測試劑盒

規(guī)格：100管/96樣 50管/48樣 

貨號 : EY-01S1229

測試方法:微量法　紫外分光光度法　　

分類：蔗糖系列

商品詳情：

測定意義：

海藻糖是由兩個糖分子以α，α-1-1 糖苷鍵連接而成的一種非還原雙糖，廣泛存在于細(xì)菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆蟲、無脊椎動物和高等植物等多種有機(jī)體中。海藻糖的非還原性決定了它對酸、堿、高溫等的穩(wěn)定性。另外，它本身具有很強(qiáng)的吸水性，使它在生物體內(nèi)具有抗脫水作用，在逆境條件下可通過識別外界刺激、產(chǎn)生和傳遞信號、基因表達(dá)和代謝調(diào)節(jié)來保護(hù)植物免受不良環(huán)境的傷害。

植物體內(nèi)主要以糖為底物合成海藻糖，該反應(yīng)首先在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸糖（UDPG）和 6-磷酸糖反應(yīng)生成中間產(chǎn)物6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶 （trehalose6-phosphate phosphatase，TPP）的作用下去磷酸化，生成海藻糖。因此，測定TPS活性對于研究植物逆境具有重要意義。

測定原理：

TPS 催化 UDPG 與 G6P 生成海藻糖-6-磷酸，同時產(chǎn)生 UDP；UDP 在丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶作用下，氧化 NADH 為 NAD+，NADH 的下降速率與 UDP 含量成正比，通過 340nm 吸光度下降速率反映 TPS 活性。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；16000g， 4℃離心20min，取上清液置冰上待測。

3、血清等液體：直接測定。

ADH測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三在25℃水浴中保溫30 min。

3. 在1mL石英比色皿中依次加入100μL樣本上清液、800μL試劑三和100μL試劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A1和A2。△A測定管=A1-A2。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后立即在340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2大于0.5，需將樣本用提取液稀釋，使A1-A2小于0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

NAD-MDH活力單位的計算：

1、血清（漿）NAD-MDH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=3.215×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，8×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000萬。

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